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Essais fonctionnels viraux et bactériens

Nexelis possède une solide expérience et une vaste expertise dans le développement, le transfert, la qualification, la validation et les tests cliniques d’essais fonctionnels viraux et bactériens.

Nous possédons également une longue expérience en développement d’essais viraux et bactériens manuels et automatisés pour des entreprises pharmaceutiques. Notre équipe de scientifiques travaille depuis de nombreuses années sur plusieurs essais utilisés pour les tests cliniques de qualité BPCL sur les vaccins, du début à la fin du développement clinique. Nos experts travaillent en étroite collaboration avec nos clients pour adapter, développer, qualifier et valider des tests spécifiques afin d’évaluer le taux d’anticorps neutralisants générés dans les essais vaccinaux.

  • Développement, qualification et validation des méthodes d’essai adaptées, en conformité avec les lignes directrices réglementaires
  • Préparation et caractérisation de banques primaires de cellules et de travail pour des essais fonctionnels viraux et bactériens
  • Transfert des méthodes développées (R&D), qualifiées et validées 
  • Instrumentation de pointe à haut débit

Essais fonctionnels viraux

Test de neutralisation par réduction des plages (PRNT) et micro-PRNT

Les échantillons de sérum humain sont dilués en série et mélangés avec une concentration standard de virus dans des plaques de 96 puits. Après incubation, les complexes sérum-virus sont ensuite transférés sur des plaques préalablement ensemencées de cellules eucaryotes et incubés à nouveau. Après incubation, les cellules sont fixées et colorées au besoin. La coloration permet la détection des plages de lyses (PFU) ou des colonies (CFU) qui correspondent à des cellules infectées. Les images de chaque puits sont acquises et comptées à l’aide d’un système automatisé d’analyse d’images. Le nombre de PFU résultants dans les puits est inversement proportionnel au taux d’anticorps neutralisants présents dans le sérum, lequel est directement proportionnel à la réponse immunologique du sujet.

Plusieurs méthodes de détection sont offertes :

  • Colorimétrie
  • Luminescence
  • Fluorescence

Neutralisation et microneutralisation

Le principe de l’essai de neutralisation est le même que celui du PRNT. Toutefois, la lecture du test est différente, car elle est indirecte et les PFU ne sont pas comptées comme paramètre d’évaluation. Selon l’approche, différentes lectures peuvent être utilisées et le niveau d’infectivité du virus peut être corrélé à la survie des cellules par exemple.

Essai de neutralisation de pseudo-particules

Dans certains cas, des pseudo-particules (virus incompétents pour la réplication) comportant un rapporteur (luciférase ou protéine fluorescente) peuvent être utilisées à la place d’un virus vivant. Dans de tels cas, l’infectivité des pseudo-particules est corrélée à la quantification du rapporteur. Nexelis dispose de plusieurs technologies pour quantifier les différents rapporteurs. L’essai de neutralisation de pseudo-particules représente une approche beaucoup plus sûre, qui peut être effectuée dans un environnement de niveau de confinement 2 en biosécurité, quelle que soit la souche virale à l’étude.

Évaluation de l’induction fonctionnelle des anticorps par le test d’inhibition de l’hémagglutination (HAI)

L’hémagglutination désigne l’agglutination des globules rouges. Comme de nombreux virus ont la capacité d’entraîner l’hémagglutination, cette propriété peut être utilisée comme lecture dans différents types d’essais. Dans le cas du HAI, les échantillons biologiques, qui sont dilués en série dans une plaque de 96 puits, ainsi que le le virus, sont pré-incubés puis mélangés avec des érythrocytes (globules rouges). Après une courte période d’incubation, la présence du virus, reflétant une quantité insuffisante d’anticorps antigéniques anti-cibles (anticorps anti-HA, comme par exemple dans le cas du virus de la grippe), est observée par l’hémagglutination des érythrocytes. Le titre d’anticorps d’un sérum correspond à l’inverse de la dernière dilution des échantillons de sérum qui inhibe complètement l’hémagglutination.

Essais fonctionnels bactériens

Essais bactéricides sériques

Les échantillons de sérum sont dilués en série dans une plaque de 96 puits. Les bactéries et du complément (humain ou de lapin) sont ajoutés aux sérums dans la plaque d’essai. Après incubation, les anticorps spécifiques des bactéries présentes dans le sérum se lient à la surface des cellules bactériennes par l’intermédiaire de protéines spécifiques ou de fragments glucidiques. Le complément se lie à la partie Fc des anticorps liés à la surface cellulaire et active la voie classique du complément, qui aboutit à la lyse (mort) des cellules bactériennes cibles. Les bactéries survivantes forment des colonies qui sont sélectionnées et comptées à l’aide d’un système automatisé d’analyse d’images. Le titre bactéricide de chaque échantillon de sérum correspond à l’inverse de la dilution sérique entraînant une destruction d’au moins 50 % des bactéries.

Essais d’opsonophagocytose

Les échantillons de sérum sont dilués en série dans une plaque de 96 puits et les bactéries sont ajoutées aux sérums dans la plaque d’essai. Pendant ce temps, les cellules phagocytaires (telles que HL60 différenciées, RAW ou macrophages/neutrophiles frais) sont mélangées au complément. Après incubation, le mélange composé de cellules phagocytaires et du complément est ajouté à la plaque d’essai. Le complément se lie à la partie Fc des anticorps liés à la surface cellulaire, ce qui déclenche la phagocytose des cellules bactériennes cibles. Les bactéries survivantes sont ensuite ensemencées sur un milieu solide approprié et forment des colonies qui sont sélectionnées et comptées à l’aide d’un système automatisé d’analyse d’images. Le titre bactéricide de chaque échantillon de sérum correspond à l’inverse de la dilution sérique entraînant une destruction d’au moins 50 % des bactéries.

Un essai similaire peut être réalisé avec des bactéries fluorescentes et être acquis par cytométrie en flux. La proportion de cellules phagocytaires qui englobent les bactéries cibles sera alors considérée comme système de détection.

Qualification du complément sérique humain

La collecte, le tri, la production et la qualification de petits et grands pools de complément humain sont effectués selon les besoins.

Acquisition de données

Les données brutes des essais bactéricides sériques et des essais d’opsonophagocytose sont acquises à l’aide d’un système d’analyse d’images des bactéries à haut débit :

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