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Analyses physicochimiques

L’expression et la purification des protéines peuvent présenter des défis importants. C’est pourquoi, dès les premières étapes d’un projet, une analyse approfondie de votre protéine est essentielle pour établir les critères attendus de votre molécule. Nexelis offre une grande variété d’analyses physico-chimiques utilisant des instruments de pointe pour comprendre la structure, l’identité, la pureté, l’activité, les propriétés immunochimiques et physicochimiques des protéines.

Fluorescence intrinsèque

La fluorescence intrinsèque est une méthode sensible pour étudier la structure des protéines. Les résidus d’acides aminés aromatiques présentent une émission de fluorescence lorsqu’ils sont excités dans la gamme de longueurs d’onde de leur spectre d’absorption. La fluorescence émise est généralement dominée par l’apport du tryptophane et de subtils changements structurels dans la conformation des protéines tertiaires dans différentes conditions (température, pH, force ionique, dénaturant) et peut être évaluée.

Fluorimétrie différentielle à balayage (DSF)

La fluorimétrie différentielle à balayage est un test de dénaturation thermique qui permet de mesurer la température à laquelle une protéine passe d’une structure bien définie à un état dénaturé par analyse de la courbe de fusion de la dénaturation thermique. Elle est également utile pour comparer la stabilité des constructions, pour déterminer les conditions optimales des tampons et pour la comparaison de lots.

Spectroscopie d’absorption UV proche à double dérivation

La dérivée seconde d’un spectre d’absorption est utilisée pour observer les signaux des trois acides aminés aromatiques dans une protéine en améliorant la résolution et en diminuant le chevauchement spectral. La variation dans le positionnement du pic dérivé de ces résidus permet d’obtenir des informations sur les altérations conformationnelles des protéines en fonction des conditions, telles que le pH, la température et la force ionique.

Réticulation par le glutaraldéhyde

Le glutaraldéhyde est un dialdéhyde linéaire à 5 atomes de carbone qui réagit principalement avec les groupements amine, mais aussi avec plusieurs autres groupes fonctionnels, comme le thiol, le phénol et l’imidazole et qui permet la fixation de la structure quaternaire de la protéine en solution. Combinée avec l’analyse SDS-PAGE, la réticulation par le glutaraldéhyde est une méthode structurelle orthogonale utilisée pour visualiser les différences de migration des protéines avant et après traitement.

Dichroïsme circulaire (CD)

La spectroscopie de dichroïsme circulaire fournit des informations basées sur la capacité d’un échantillon à absorber différemment la lumière à polarisation circulaire droite et la lumière à polarisation circulaire gauche. Le dichroïsme circulaire est un outil sensible qui fournit des informations sur la composition de la structure secondaire (hélice alpha, feuillet bêta, coude bêta et structure aléatoire) basée sur l’absorption par les liaisons peptidiques dans l’UV lointain et sur la structure tertiaire basée sur l’absorption par les liaisons acides aminés aromatiques et disulfure dans l’UV proche. Le dichroïsme circulaire est principalement utilisé pour surveiller les changements structurels induits par le pH ambiant, les dénaturants et la température.

Analyse de la déglycosylation des protéines

La glycosylation est l’une des modifications post-traductionnelles les plus courantes des protéines et entraîne souvent une hétérogénéité de la masse et de la charge des glycoprotéines. Une grande quantité d’informations sur la structure d’une glycoprotéine peut être obtenue en éliminant les oligosaccharides par déglycosylation enzymatique. La différence de migration des protéines sur SDS-PAGE avant et après le traitement à la glycosidase peut fournir des données précieuses sur l’état de glycosylation d’une protéine d’intérêt.

Calorimétrie différentielle à balayage (DSC)

La calorimétrie différentielle à balayage est utilisée pour évaluer la stabilité des protéines à l’état natif qui mesure directement la température de transition (Tm) structurelle induite thermiquement, sans l’utilisation d’un colorant extrinsèque. La calorimétrie différentielle à balayage surveille les événements de dénaturation thermique en mesurant les variations de la capacité calorifique apparente excessive des échantillons de protéines pendant le balayage ascendant de la température à pression constante.

Vélocité de sédimentation par ultracentrifugation analytique (SV-AUC)

L’ultracentrifugation analytique mesure la vitesse à laquelle les molécules se déplacent dans leur tampon en réponse à la force centrifuge. Cette vitesse de sédimentation fournit des informations sur la masse et la forme moléculaires. L’ultracentrifugation analytique sépare les espèces protéiques directement en solution, sans l’utilisation d’une phase stationnaire telle que la chromatographie d’exclusion de taille.

Diffusion dynamique de la lumière (DLS)

La diffusion dynamique de la lumière est utilisée pour déterminer la distribution du rayon hydrodynamique de la protéine par la mesure des fluctuations de l’intensité de la lumière diffusée et le calcul du coefficient de diffusion translationnelle des protéines à l’état natif. Elle permet ainsi d’évaluer le niveau de l’état oligomérisation et la distribution des protéines dans l’échantillon.

Chromatographie d’exclusion de taille avec mesure de la diffusion de la lumière sous multiples angles (SEC-MALS)

La technologie MALS, combinée à la chromatographie d’exclusion de taille, mesure la masse molaire absolue de chaque pic, indépendamment de la forme moléculaire ou de la position d’élution des fractions d’échantillon. La chromographie SEC-MALS est une excellente méthode pour la détermination de la taille d’une protéine ou d’un complexe en solution.

Microscopie électronique

La microscopie électronique est une technique permettant d’obtenir des images à haute résolution d’échantillons biologiques après coloration négative. Les images sont prises avec un grossissement approprié.

SME – INRS-Institut Armand-Frappier 05-21-19 16:53 40000 11.0 75.0 Imaging NL1904A T0 1/100 NeoMed LABS-Martine Boyer VLPs XpixCal=1.938 YpixCal=1.938 Unit=nm ##fv3

Cartographie des peptides par spectrométrie de masse

La cartographie des peptides permet de confirmer l’identité en fournissant la confirmation de la séquence d’acides aminés primaires ainsi que l’identification et la quantification des modifications post-traductionnelles et la surveillance des événements de dégradation après clivage de la protéine en peptides protéolytiques.

Mesure d’affinité et analyse des interactions biomoléculaires

La plateforme de biocapteurs d’interférométrie de bio-couche (BLI), mise au point par FortéBio, est un système de détection en temps réel sans marquage pour l’analyse des interactions moléculaires, basé sur les principes de l’interférométrie optique. L’interférométrie de bio-couche mesure les interactions biomoléculaires en analysant les modèles d’interférence de la lumière blanche réfléchie par la surface d’une pointe de biocapteur. La plateforme BLI peut être utilisée pour la quantification des protéines/anticorps, pour l’analyse de l’affinité et de la cinétique et pour déterminer la constante d’affinité de liaison (KD).

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